2024年2月，武汉大学澳门新葡游戏网罗孟成教授实验室与西湖大学马丽佳教授实验室合作的文章Machine learning-based prediction models to guide the selection of Cas9 variants for efficient gene editing发表于Cell reports杂志。该论文采用了体外合成gRNA-target pairs的方法构建了超过360k的Oligo文库，并结合机器学习成功开发了用于帮助指导Cas9突变体以及gRNA优化选择的模型工具。武汉大学博士生李健波、吴攀峰以及西湖云谷智药曹周涛为共同第一作者；武汉大学澳门新葡游戏网罗孟成教授和西湖大学马丽佳教授为共同通讯作者；武汉大学为论文第一完成单位。

Cas9介导的基因编辑包含了Cas9核酸酶以及gRNA两个主要组成部分，在gRNA的指引下完成靶序列的特异性编辑。尽管Cas9已经广泛的应运于微生物、动物、植物的基因编辑中，但是其经典的“NGG”PAM序列以及潜在脱靶风险仍阻碍着其在科研以及医疗中的应运。因此针对Cas9基因编辑系统的优化主要也围绕在Cas9核酸酶和gRNA上进行。目前对Cas9核酸酶的优化不仅包括在一些其他物种中探索发现新的同源核酸酶（如：FrCas9，CjCas9，NmCas9，SaCas9等），还包括了一些重新设计SpCas9蛋白编码序列的衍生突变体（如：SpCas9-NG，xCas9，HiFi Cas9，Sniper Cas9，evoCas9，Hypa Cas9，SuperFi Cas9等）。这些Cas9核酸酶或是可以编辑一些NGG以外的靶基因组位点或是拥有更小的脱靶风险，他们的出现无疑丰富了基因编辑系统工具的选择。在这些突变体的帮助下，无论是生殖、肿瘤亦或是其他领域都可以通过他们实现更高效的动物、细胞模型构建以及其他多方面用途。

同时近年来随着人工智能与生物医疗领域的紧密结合，基于机器学习模型的gRNA优化工具也在飞速发展，然而目前绝大多数的工具更多的聚焦于野生型SpCas9，针对一些极具潜力的Cas9突变体的研究尚缺乏足够的实验数据。在本研究中团队成员构建了一个包含多个Cas9突变体（SpCas9-NG，HiFi Cas9，Sniper Cas9，LZ3 Cas9）的高通量数据库，并以此为基础结合机器学习模型构建出8个用于分析不同突变体编辑活性以及特异性的预测模型，以保证提高Cas9编辑效率的同时有效规避脱靶风险。除此之外，本研究中也发现PAM远端区域的核苷酸组成对于HiFi Cas9和LZ3 Cas9的编辑活性发挥着重要作用。这部分非种子区域在此前的报道中对于野生型Cas9以及其他突变体并不会显著影响其编辑效率，该发现也进一步解释了HiFi Cas9和LZ3 Cas9具有更高编辑特异性的原因

总之，该研究为Cas9突变体的选择提供了一个很好的指导，帮助动物模型和细胞模型研究人员选择更适合，更高效的基因编辑工具。为了给来自不同领域的科研工作者带来更好的使用体验，这些Cas9突变体的预测工具可以通过访问我们的网站指导Cas9突变体的选择以及了解基因组靶序列的gRNA编辑活性和特异性排名（https：//crispr-aidit.com/home）。

该研究获得了武汉大学泰康生命医学中心、国家自然科学基金（32270905）、湖北省重点研发项目（2021BCA111）、辉凌生殖医学项目（FIRMC200509）、武汉大学中南医院-泰康医学院联合项目（ZNJC201928）等项目的资助。

原文链接：Machine learning-based prediction models to guide the selection of Cas9 variants for efficient gene editing - PubMed (nih.gov)。

据悉，罗孟成教授本科和博士均毕业于武汉大学，博后在美国宾夕法尼亚从事生殖发育研究。 2016年获批国家级青年人才项目回国建立独立科研团队，研究方向聚焦于精子发生与男性不育，采用基因编辑手段构建动物模型，致力于阐明男性不育的致病机制，开发临床诊治方案和男性避孕药。至今为止，罗孟成教授在男性生殖领域已取得多项重要成果，包括： 1）发现并命名了一个X染色体上的雄性性别决定基因SDX，完善了哺乳动物雄性性别决定理论；2）揭示了Dot1l在精原干细胞自我更新过程中的作用机制；3）鉴定了一个人类不孕不育新靶标-MEIOB。近五年以通讯/共同通讯作者身份发表Cell Reports(2024)、Cell Research（2022）、Genes & Development(2022)、Cell Proliferation（2021）、 Science Advances（2020）等文章多篇。其中，MEIOB基因突变会导致人类男性和女性完全不育，相关成果已收录入领域核心综述和教材，并作为非梗阻性无精子症（NOA）检测基因之一收录入中外临床共识和指南，在生殖临床上全面推广应用，目前正在研发针对MEIOB的男性避孕药。SDX基因调控支持细胞发育和功能，其突变导致性别逆转或睾丸早衰，已得到临床病例支持，正在研究致病机制和临床诊治方案。

（撰稿：李健波  审稿：梁凯威）